摘要：Y染色體無精子癥因子（AZF）缺失檢測是診斷無精子癥和嚴重少精子癥的關鍵技術。作為2013年EAA/EMQN指南的修訂版，新版指南在回顧總結以往臨床相關進展的基礎上，對舊版指南內(nèi)容進行了大量更新，并對EAA/EMQN提供的外部質量評估項目結果做出了反饋。基礎多重PCR檢測體系結合擴展性缺失分析，仍然是目前檢測和正確解釋AZF缺失的金標準。同時，對sY84引物序列進行了更新，且對AZFa和AZFb缺失斷點的可互換邊界位點也進行了改進。具體而言，新版指南不再推薦sY83和sY143被用于擴展性缺失分析，而是將sY1064和sY1192作為首選位點。盡管目前有些國家AZF缺失檢測正在向注冊試劑盒化過渡，但應注意的是，許多商業(yè)產(chǎn)品由于包含大量不必要位點而不被推薦使用。此外，目前這些可用產(chǎn)品都不符合用于擴展性缺失分析的新首選位點。AZFc區(qū)域gr/gr部分缺失是精子發(fā)生障礙人群特異性危險因素，也是睪丸生殖細胞腫瘤的易感因素。但這種缺失類型的檢測與否仍需由診斷實驗室和送檢臨床醫(yī)生自行決定。鑒于EMQN/EAA計劃運行22年的經(jīng)驗表明，參與計劃的實驗室基因型診斷錯誤率大幅下降，診斷報告質量也極大改善，強烈鼓勵AZF檢測實驗室每年參與該外部質量控制計劃。

 

Y染色體無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）缺失是導致男性不育的第二大遺傳因素，其發(fā)生率僅次于克氏綜合征。在普通人群中，約每4000名男性中就有1人存在Y染色體微缺失，而在不育男性中其發(fā)生率更高。不同實驗室AZF微缺失發(fā)生率為2%~10%（甚至更高），主要由研究人群組成差異導致。通常，接受外部機構送檢的常規(guī)診斷實驗室在沒有控制患者選擇的情況下的發(fā)病率要低得多，通常低于2%。
已發(fā)表數(shù)據(jù)和質量控制計劃都證實，不同實驗室采取的檢測方案差異，確實會導致不準確或完全錯誤的診斷，表明檢測標準化和質量控制的必要性。也因此，歐洲男科學會（EAA）和分子遺傳質量協(xié)作網(wǎng)（EMQN CIC）聯(lián)合開始提供外部質量評估（EQA）計劃，并定期發(fā)布Y染色體微缺失分子診斷的實驗室指南。

經(jīng)10年數(shù)據(jù)積累，本次EAA/EMQN關于Y染色體AZF微缺失分子診斷指南作出了大量更新，以更好服務于臨床。更新要點：
01 AZFa近端邊界位點sY83和sY1064不可互換，因為它們的結果取決于檢測到的AZFa完全缺失近端斷點的變化。重要的是，AZFa完全缺失可以與sY83（present）和sY1064（absent）兼容。因此，在強制擴展性缺失分析中只推薦sY1064，而不推薦sY83。
02 AZFb遠端邊界位點sY143和sY1192不能互換，只有sY1192能夠區(qū)分AZFb完全和部分缺失（從而為TESE成功與否提供可靠預后）。因此，在強制擴展性缺失分析中只推薦sY1192，而不推薦sY143。
03 對sY84的正向引物和反向引物序列進行了更新，以避免正向引物錯配，同時反向引物兼容亞洲人群的SNP。
04 AZFb缺失斷點的可變性可導致大量AZFb和AZFbc完全缺失中sY1224近端邊界位點的保留。盡管這種變異的表型尚不清楚，但建議優(yōu)先使用sY121，再使用sY1224（如果sY121缺失）。
05 據(jù)目前所知，擴展性缺失分析中首選位點的變化與目前市面上任何AZF缺失分子診斷試劑盒都不完全兼容。

 

一、Y染色體微缺失遺傳學檢測的適應癥

AZF缺失檢測的精液評估閾值尚未達成共識。精子濃度<2×106/mL的無精癥或嚴重少精癥患者一般能夠發(fā)現(xiàn)臨床相關的缺失，而精子濃度在2~5×106/mL之間的不育患者很少有此發(fā)現(xiàn)。2010版《WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊》將生精指標改為精子總數(shù)，歐洲臨床指南現(xiàn)今仍然將AZF缺失檢測的精子總數(shù)閾值設定為＜500萬精子/mL；然而，在精子濃度>1×106/mL的男性中，該檢測的成本效益受到質疑。但無論如何，一致建議對無精子癥男性進行Y染色體缺失篩查，因為它不僅可以提供病因診斷，而且可以對TESE的成功率進行可靠估計。

圖1為本指南建議的分析步驟流程圖，分為基礎檢測體系和擴展性檢測體系。常規(guī)臨床參數(shù)，如激素水平、睪丸體積、精索靜脈曲張、睪丸發(fā)育不良、感染等，沒有任何預測價值。通常，染色體異常（46,XY/45,X核型除外）、梗阻性無精子癥（除非FSH高于正常限值）或促性腺功能減退癥患者不需要進行Y染色體分子分析。然而，在非特發(fā)性不育男性中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多缺失攜帶者，即患有睪丸腫瘤、附睪閉塞、睪丸炎、精索靜脈曲張或化療/放療后的患者。因此，任何伴有無精子癥或嚴重少精癥的診斷都應該是AZF檢測的指征。例如，對屬于上述精液類別的男性，在精索靜脈曲張切除術前進行AZF篩查很重要，因為缺失攜帶者很可能不會從手術中受益。Klinefelter患者檢測Y染色體缺失的臨床實用性尚未確定。

圖1（A）AZF基礎檢測體系及診斷流程

 

 

圖1（B）AZF擴展性缺失檢測體系及診斷流程

 

 

二、Y染色體男性特異性區(qū)域結構

Y染色體男性特異性區(qū)域（MSY）參考序列包含156個轉錄單位（其中包括78個蛋白質編碼基因，編碼27種不同的蛋白質），分為三種類型：X-退化區(qū)（X-degenerate；來自染色體祖先狀態(tài)的單拷貝基因或假基因）、X-換位區(qū)（X-transposed；從X染色體獲得，與相應的X區(qū)域99%同源）以及擴增區(qū)（ampliconic）。其中，后者對應于重復區(qū)，分為多個家族類型，每個重復區(qū)在家族內(nèi)重復之間共享幾乎完全（>99.9%）的同一性。擴增區(qū)包含9個睪丸特異性或富集表達的蛋白質編碼基因家族。最初，這些家族估計至少有60個編碼基因，現(xiàn)在這個數(shù)字已經(jīng)增加到超過100個。由于擴增區(qū)的高度重復性，既可以進行基因轉換，也可以進行非等位基因（染色體內(nèi)）同源重組（NAHR）。擴增子可以沿著MSY以有序的方式排列，從而形成回文：在MSY的相當長范圍內(nèi)延伸的不同擴增子重復的鏡像塊。擴增子（和回文）組織增強了結構變異的產(chǎn)生，如缺失、重復和倒位。普遍認為，NAHR是產(chǎn)生AZF完全缺失的主要驅動力。這些交換發(fā)生在具有相同反向高度同源重復序列之間，導致它們之間遺傳物質的丟失（以及姐妹染色單體中的相互重復）。考慮到MSY的高度重復性體系結構，已經(jīng)確定了許多不同的MSY重排。只有明確確定與男性不育相關的才是本指南的重點。

 

三、Y染色體缺失類型及其分子機制

圖2 Y染色體示意圖和臨床相關微缺失模式

 

本指南依舊沿用經(jīng)典Y染色體微缺失區(qū)域的定義模式，分為：AZFa區(qū)缺失、AZFb區(qū)缺失、AZFbc區(qū)缺失和AZFc區(qū)缺失。

 AZFa區(qū)域：長792kb，包含單拷貝基因USP9Y（原DFFRY）和DDX3Y（原DBY）。第三個基因，UTY，功能未知，定位于該區(qū)遠端。AZFa完全缺失的起源可追溯到HERVyq1和HERVyq2逆轉錄病毒序列中同向的相同序列塊之間的NAHR。重組可發(fā)生在這些逆轉錄病毒序列（ID1和ID2）中兩個相同序列塊中的一個，導致至少兩種略有不同的缺失模式。無論如何，AZFa完全缺失都丟失了約792kb，包含USP9Y和DDX3Y缺失。

 AZFb和AZFc這兩個區(qū)域共包含24個不同的基因，其中大多數(shù)存在于多個拷貝中。AZFb完全缺失刪除了6.2Mb（包括32個轉錄單位），并且是由P5/近端P1回文之間的NAHR引起。因此，AZFb完全缺失也可以稱為P5/近端P1缺失。AZFc區(qū)包括12個基因，每個基因以可變拷貝數(shù)存在，總共32個轉錄單元。AZFc完全缺失去除3.5Mb（共21個轉錄單元，其中10個被認為是蛋白質編碼），并分別源自回文P3和P1中b2和b4擴增子之間的NAHR。類似于AZFb缺失，AZFc完全缺失也可以基于NAHR事件的干預靶點（即b2/b4缺失）來參考。

 AZFb和AZFc區(qū)域的異常重復增加了額外重排的發(fā)生，這些重排也可能與它們對精子發(fā)生的影響有關。一些對應于幾乎全部去除AZFb和AZFc區(qū)域的缺失模式。這些AZFbc缺失是通過兩種主要機制發(fā)生的，涉及P5/遠端P1之間（7.7Mb，丟失42個轉錄單位）或P4/遠端P1之間（7.0Mb，失去38個轉錄單位）的NAHR。此外，AZFc區(qū)域內(nèi)較少的缺失（部分缺失）也會限制精子發(fā)生，這些是本指南重點。

綜上所述，以下復發(fā)性Y染色體完全微缺失具有臨床相關性，是無精子癥或嚴重少精癥男性生精障礙的原因（圖2）：
—AZFa
—AZFb（P5/近端P1）
—AZFc（b2/b4）
—AZFbc（P5/遠端P1或P4/遠端P1）

最常見的完全缺失類型是AZFc缺失（70%-80%），其次是AZFa缺失（0.5%-9%）、AZFb缺失（1%-7%）和AZFbc缺失（1%-20%）。AZFabc缺失最有可能與異常核型有關，如46,XX男性或iso(Y)。

 

 

四、AZF完全缺失的基因型-表型相關性

AZF缺失與生精失敗特異性相關。盡管已經(jīng)報道了一些罕見的AZFc完全缺失自然傳播病例，但它們主要反映了這樣一個事實，即在特殊條件下，精子數(shù)量非常低的男性可以進行自然受精。因此，將Y缺失視為無精子/少精子癥的原因而不是“不育”的原因更為合適。AZF缺失檢測具有預后價值，并可能影響治療選擇。應為所有符合TESE結合卵胞漿內(nèi)單精子注射（TESE-ICSI）條件的無精子癥患者提供缺失篩查。

 AZFa區(qū)域完全缺失導致唯支持細胞綜合征（SCO）睪丸表型和無精子癥。AZFa區(qū)域完全缺失表明TESE-ICSI幾乎不可能取到睪丸精子。

 AZFb和AZFbc區(qū)域（P5/近端P1、P5/遠端P1、P4/遠端P1）完全缺失與無精子癥有關，大約一半的男性具有SCO睪丸表型，另一半表現(xiàn)為生精性阻滯（通常具有正常的FSH和正常的睪丸體積），從而阻止男性配子的成功產(chǎn)生。與AZFa完全缺失類似，AZFb完全缺失的男性也幾乎不可能通過TESE獲得精子。然而，罕見的非典型AZFb或AZFbc缺失也可嘗試利用TESE進行取精，這種缺失特征為P4回文的近端斷點（而不是P5）。事實上，在P4處具有近端斷點的較小缺失可能與額外的AZFb基因拷貝的保留有關，如XKRY、CDY2和HSFY，因此導致了TESE陽性結果的可能。同樣，通過保留遠端sY1192位點（擴展性缺失分析的一部分）確定的部分AZFb缺失也可以與殘余精子兼容。強調區(qū)分完全（P5/近端P1）和部分AZFb缺失的重要性。考慮到以上情況，新版指南建議在強制擴展性缺失分析步驟中，確定AZFb缺失的遠端斷點時，將sY1192作為首選位點，而不是sY143。需要強調的是，不僅遠端斷點，近端斷點也可以區(qū)分TESE陰性和TESE陽性患者。因此，執(zhí)行擴展性缺失分析是最重要的，因為該信息將最終確定是否應該嘗試TESE。只有完整的檢測結果（包括基礎和擴展性缺失位點）才能對AZFb缺失男性的生殖選擇提供必要見解。在sY1192陰性P5/近端P1缺失的情況下，不建議使用TESE，因為提取到精子的機會非常低/幾乎為零。然而，應該注意的是，可能由于遺傳背景效應，sY1192陰性的AZFb和AZFbc缺失與完全精子發(fā)生相兼容的情況雖極為罕見，但也有發(fā)生。

 AZFc完全缺失（b2/b4）與無精子癥或嚴重少精子癥有關，對精子發(fā)生有強烈的有害影響。但與AZFa和AZFb相反，AZFc完全缺失也有可能有殘留精子發(fā)生。多項研究表明，與這種缺失類型相關的生精損傷表型會隨著時間的推移而加重，但也有研究未能復現(xiàn)這種影響。AZFc完全缺失患者通過TESE獲得精子的幾率平均約為50%，但差異很大（從15%到71%），一方面是患者自身生物學上的差異，另一方面也說明了TESE技術方面的差異。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，外周血中45%以上的X細胞系可被認為是精子發(fā)生的負面預測因素。

 

五、遺傳咨詢

5.1 遺傳咨詢

遺傳咨詢是強制性環(huán)節(jié)，以向患者提供有關妊娠精子發(fā)生受損男性后代風險的相關信息。

 AZFc缺失以及AZFa和AZFb部分缺失，因為其可遺傳性，需要對其男性家庭成員進行遺傳咨詢。

 AZFa、AZFb和AZFabc的完全缺失通常沒有精子產(chǎn)生，因此不建議進行家族篩查，也不應在報告中提及。

 非終端AZFbc缺失通常與非參考Y染色體相關，在一些非典型缺失病例中，盡管生精功能嚴重受損，但仍可能有精子發(fā)生。這類缺失將強制性地傳遞給其男性后代，因此，患者應被告知妊娠精子發(fā)生受損男性后代的風險。

 

5.2 生殖策略

 如果精液或睪丸中存在精子，AZF缺失患者可以自然受孕（在一些極罕見的AZFc完全缺失的病例中）或通過MAR受孕。AZFc完全缺失患者行ICSI的研究已有報道，個別研究發(fā)現(xiàn)缺失對關鍵MAR參數(shù)有負面影響，如受精率、胚胎質量和活產(chǎn)率下降，但大多數(shù)研究沒有發(fā)現(xiàn)AZFc完全缺失與未缺失男性在受精率和妊娠率方面存在任何顯著差異。因此，這種缺失是否對MAR結果有任何顯著影響仍然是一個有爭議的問題。近期一項基于12項研究的薈萃分析表明，與沒有遺傳異常的患者（使用精液精子或睪丸精子）相比，缺失患者除受精率顯著下降外，其他生殖結果（如胚胎質量、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率）都沒有變化。

 Y染色體微缺失的傳播對后代健康的潛在影響是一個激烈爭論的問題。雖然父親的缺失必然會遺傳給男性后代，從而導致子代精子發(fā)生受損，但由于不同的遺傳背景和不同環(huán)境因素對生殖功能的影響，確切的睪丸表型無法預測。據(jù)報道，受Yq微缺失影響的父親經(jīng)ICSI所生嬰兒的數(shù)量仍然相對較低，只有268例有充分記錄。這些兒童中，除了一名在出生時患有肺動脈閉鎖和右心室發(fā)育不全以及一名患有非特定“嚴重畸形”外，表型似乎都正常；而這兩名兒童的父親都攜帶AZFc缺失。人們對后代患特納綜合征（45,X）的潛在風險以及與性染色體嵌合體相關的其他表型異常（包括生殖器模糊）表示擔憂。關于患有Y微缺失的男性和具有嵌合46,XY/45,X染色體核型和/或Turner患者數(shù)據(jù)表明，一些Yq微缺失可能與整體Y染色體不穩(wěn)定有關，這可能導致45,X細胞系的形成。在268例報告的Yq缺失父親所生的ICSI嬰兒中，沒有觀察到生殖器模糊或特納綜合征。

 兩篇論文報道了對來自Y染色體缺失攜帶者的胚胎進行植入前遺傳診斷，并提供了胚胎非整倍體率的數(shù)據(jù)。其中一項研究沒有發(fā)現(xiàn)性染色體異常，而另一項研究發(fā)現(xiàn)了更高比例的X單體胚胎。建議在與患者討論染色體異常的風險時要謹慎。此外，由于攜帶45,X染色體核型的胚胎有很高的自然流產(chǎn)風險，Yq缺失男性伴侶流產(chǎn)率可能更高。然而，這種可能性還有待正式檢驗。

 沒有證據(jù)表明AZFc完全缺失與后代的智力、心理或運動發(fā)育障礙有關。位于假常染色體區(qū)（PAR）的SHOX（矮小同源盒）基因的單倍體充足性的假定關聯(lián)在更大的多中心研究中沒有被復現(xiàn)，也沒有在智利人群的獨立研究中發(fā)現(xiàn)。后者僅在等臂染色體Yp和/或Y缺對相關的終端AZFbc缺失患者中發(fā)現(xiàn)了PAR異常。這項研究還報道了7名AZFbc終端缺失和核型異常患者中的5名出現(xiàn)神經(jīng)障礙。值得注意的是，這一發(fā)現(xiàn)在更大的隊列中的驗證仍有待確定。

總之，Y染色體微缺失的分子診斷指征是基于嚴重生精量減少，強烈建議無精子癥和嚴重少精癥患者進行檢測。然而，需要AZF缺失檢測的嚴重少精癥的閾值（1×106/mL至5×106/mL精子濃度范圍內(nèi)）仍存在爭議（見上文）。AZF檢測對精子提取具有預后價值，如果在精液或睪丸活檢中發(fā)現(xiàn)精子，則缺失將傳遞給男性后代。雖然數(shù)據(jù)存在異質性，但最新薈萃分析表明，除受精率外，Y染色體重排不會顯著影響MAR結果。盡管在過去10年間，父親Y染色體缺失所生嬰兒的數(shù)量進一步增加，但仍然沒有關于特納綜合征、生殖器模糊或其他染色體異常的確切風險的明確信息。顯然，有必要針對Yq缺失的男性及其潛在后代制定強有力的后續(xù)計劃。AZFc完全缺失和AZFb或AZFa部分缺失時，應在實驗室報告中要求對該家族的男性成員進行分析。此外，AZFc完全缺失或Yq終端缺失時，建議進行廣泛的核型分析（計數(shù)100個中期），以排除與結構異常的Y染色體相關的46,XY/45,X嵌合體。

 

六、AZF部分缺失

6.1 AZFa區(qū)域基因特異性缺失
盡管一些研究發(fā)現(xiàn)單個AZF基因缺失的發(fā)生頻率非常高，但這些數(shù)據(jù)與一項包含2000多名患者的大樣本研究結果大相徑庭。所有已確認的AZF基因特異性缺失（具有明確的斷點）均位于AZFa區(qū)，其中5個特異性缺失部分或完全影響USP9Y基因。基因特異性缺失均不是由NAHR引起的，其特異性導致此類事件極為罕見，而且AZFa部分缺失的相關表型異質性很大，從無精子癥到正常精子癥都可能發(fā)生，提示USP9Y是精子發(fā)生過程中的精細調節(jié)因子，而并不是決定性因子。此外，DDX3Y的功能缺失變異是無精子癥的病因，該基因也是AZFa區(qū)域的關鍵生精因子。

6.2 AZFc部分缺失——gr/gr缺失及其臨床意義
AZFc區(qū)域特別容易受到NAHR事件的影響，從而可能導致部分缺失和重復。其中，gr/gr缺失是被研究得較為廣泛的一種，該缺失可以造成AZFc區(qū)域近一半的基因丟失（具有生殖細胞獨有或顯性表達的基因）。gr/gr缺失的表型高度可變，從無精癥到正常精子量表現(xiàn)不一，對生精的影響依然存在爭議。且該缺失表型具有群體依賴性以及可能是TGCT的誘發(fā)因素，并可能在子代中擴展為AZFc區(qū)的完全缺失。因此，gr/gr缺失是精子生成障礙遺傳分析風險因素的一個特例，其是否作為常規(guī)檢測尚未達成共識，需由診斷實驗室和送檢臨床醫(yī)生自行決定。

6.3 診斷指南
檢測AZF缺失的首選方法是對Y染色體的選定區(qū)域進行PCR擴增。已有研究表明，與定位于非編碼區(qū)的有效位點相比，使用基因特異性序列位點（STS）并沒有提高臨床相關微缺失的檢測率。因此，從臨床角度來看，所選位點是擴增匿名區(qū)域還是擴增特定的MSY基因基本上并不重要。真正至關重要的是，所選擇位點能夠顯示出一致的微缺失模式。

6.3.1 AZFa缺失檢測
AZFa區(qū)域的分子檢測使用兩個STS標記：sY84和sY86。兩者都位于USP9Y和DDX3Y基因上游。根據(jù)缺失的致病機制和現(xiàn)有數(shù)據(jù)，sY84和sY86同時缺失時，并不是100%的AZFa完全缺失，但其概率是非常高的，有可能（盡管很少）兩個位點都缺失而不影響AZFa的兩個基因，或只有USP9Y基因受到影響。因此，AZFa缺失檢測需要進行強制性的擴展性缺失分析，包括近端邊界sY82（present）/sY1064（absent）以及遠端邊界sY1065或sY1182（absent）/sY88（present）。近期數(shù)據(jù)表明，相當一部分AZFa完全缺失病例中，近端斷點標記sY83（既往版本作為sY1064的等效選項）仍然存在。因此，為了避免將AZFa完全缺失誤診為部分缺失，強烈建議在擴展性缺失分析中使用sY1064而不是sY83（或者至少應該檢測sY1064，以證實在sY83陽性病例中確實是完全缺失）。這兩個AZFa基因位于AZFa區(qū)域更遠端，因此檢測推薦遠端AZFa位點與TESE預后非常相關，且近端斷點的確切位置（sY83存在或不存在）實際上并不影響對缺失的臨床解釋。如果只發(fā)現(xiàn)sY84或sY86缺失（排除擴增失?。?，則應對AZFa區(qū)域進行更詳細的研究。然而，這一事件目前被認為是非常罕見的。

6.3.2 AZFb缺失檢測
sY127和sY134分別位于AZFb區(qū)域的中端和遠端。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，絕大多數(shù)情況下，兩個位點缺失即可表明AZFb區(qū)域完全缺失。但為了明確TESE的預后，需要使用額外位點進行強制擴展性缺失分析，所選用位點包括：近端邊界的sY105（present）、sY121/sY1224（absent），以及遠端邊界的sY1192（absent）和sY153（present）。需要注意的是，以前版本認為sY143或sY1192是可以等效的，但最近數(shù)據(jù)表明，sY1192（而不是sY143）對TESE預后有價值。此外，近期數(shù)據(jù)還表明，以前版本中推薦的sY1224（相當于sY121）在相當數(shù)量的AZFb和AZFbc完全缺失患者中仍然存在。盡管這種變異的表型仍有待表征，但強烈鼓勵使用位點sY121和sY1224（當sY121不存在時）。再次重申之前的建議，即反對檢測位點sY114和sY152（仍包含在一些商業(yè)試劑盒中），因為它們定位于染色體上多個基因組區(qū)域中。特別地，sY152定位于DAZ基因，類似于sY255和sY254。在這方面，再次強調，根據(jù)sY152的假設缺失定義的所謂“AZFd”區(qū)域并不存在。盡管一些商業(yè)試劑盒仍然包含這個假定區(qū)域，但強烈建議不要使用此類產(chǎn)品。

6.3.3 AZFc缺失檢測
位點sY254和sY255是DAZ基因的特異性標記位點，DAZ基因在Y染色體序列中以四個拷貝的形式存在，排列在兩個簇中。當sY254和sY255同時缺失時，即可診斷AZFc區(qū)完全缺失。基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，這兩個位點中單一位點的缺失是極不可能的，提示方法學錯誤。強制擴展性缺失分析使用異染色質位點sY160區(qū)分完全AZFc缺失（b2/b4缺失模式，sY160存在）和終端缺失（sY1160缺失）。終端缺失以及b2/b4缺失可能與嵌合核型（46,XY/45,X）有關，因此，出于TESE預后原因，也應要求進行核型分析。

如果實驗室決定檢測gr/gr部分AZFc缺失，可以通過使用兩個位點來實現(xiàn)：sY1291和sY1191；位點sY1291缺失和sY1191存在即可進行判斷。值得注意的是，一項多中心研究中檢測到5%的假缺失率，強調了優(yōu)化PCR條件和額外驗證步驟的重要性。建議對亞洲患者進行Y單倍群分析，以排除不太可能影響精子發(fā)生的Y譜系固定缺失。

6.3.4 檢測AZFbc缺失
sY127、sY134、sY254和sY255四個位點全部缺失提示AZFb和AZFc區(qū)域均完全缺失。更特異性的位點sY116可以用于確定AZFbc的缺失模式，如P4/P1遠端缺失，sY116存在，或P5/P1遠端缺失時sY116也缺失，該定義具有臨床預后價值。強烈建議AZFbc缺失時進行異染色質位點sY160檢測，以確定是否存在終端缺失。

6.4 PCR反應體系的建立：內(nèi)部質量控制和推薦位點
臨床診斷中，基因組DNA的PCR擴增需要嚴格遵守良好的實驗室規(guī)范和質量控制的基本原則，檢測時必須平行檢測陽性和陰性對照。AZF缺失檢測時，應同步檢測陽性和陰性對照，即一個精子發(fā)生正常的男性樣本和一個女性樣本。此外，需加入空白對照——水樣（只是用水代替模板DNA，包含除模版DNA外所有成分的PCR反應）。每一組PCR反應都至少采用兩管或更好的多重PCR進行。SRY基因是男性性別決定基因，位于Y染色體短臂，作為內(nèi)對照，SRY基因可以在ZFY基因丟失時證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。AZF診斷中另一個重要內(nèi)對照是ZFX/ZFY基因，ZFX/ZFY檢測不僅與女性對照DNA相關，而且與SRY陰性的46,XX男性相關，是唯一的陽性標記。
原則上，在每個AZF區(qū)域中僅分析一個非多態(tài)性STS位點，就足以確定AZFa、AZFb或AZFc中是否存在缺失。然而，任何一個已知缺失區(qū)域都包括多個STS位點，分析每個區(qū)域中的2個STS位點可以提高診斷的準確性。因此，在檢測的第一步（基礎檢測分析）中，每個AZF區(qū)域中至少應分析2個STS位點?；诒姸鄬嶒炇医?jīng)驗，外部質量控制結果，并考慮到多重PCR擴增的形式，以前版本指南中推薦的STS引物的首選仍然有效。這些引物包括：
AZFa：sY84*；sY86
AZFb：sY127；sY134
AZFc：sY254，sY255（均在DAZ基因中）

*更新了sY84-F和sY84-R的序列。根據(jù)最新測序數(shù)據(jù)，sY84-F引物序列中間位置存在錯配，新指南對引物序列進行了修正。關于sY84-R，在亞洲人群中檢測到引物序列第5核苷酸位置存在一個基因多態(tài)性SNP（rs72609647）。因此，如果該來源的樣本擴增失敗，應檢測sY84的替代引物和/或sY84的替代鄰近位點。

對于強制擴展性缺失分析，推薦的引物為：
AZFa：近端斷點：sY82和sY1064；遠端斷點：sY1065（或sY1182）和sY88
AZFb：近端斷點：sY105和sY121/sY1224；遠端斷點：sY1192和sY153
AZ1Fc：sY160

總之，這兩種引物組的使用足以用于常規(guī)診斷，能夠檢測幾乎所有臨床相關的AZF缺失以及文獻中報道的95%以上的缺失，同時為TESE提供足夠的預后價值。強烈鼓勵所有實驗室采用這些位點，便于實驗室質量控制，并將檢測差異降至最低。

6.5 檢測結果及重復檢測結果解釋
指南建議的方案都經(jīng)過認真設計和優(yōu)化，采用兩管多重PCR反應，每管多重PCR反應體系中都包括每個區(qū)域的一個位點。因此，當樣本中發(fā)生完全缺失時，兩管PCR反應都應顯示該區(qū)域特異性位點缺失。雖然如果相關區(qū)域僅一個位點缺失，AZFa和AZFb區(qū)域的部分缺失是可能的，但僅sY254或sY255（AZFc/DAZ）的選擇性單個位點缺失通常被視為方法學錯誤。如果只有一個AZFa或AZFb位點缺失，則首先必須仔細求證該缺失情況，然后對整個區(qū)域進行更詳細的研究。如果AZFabc缺失（所有8個Yq位點都缺失），則對照位點（SRY和ZFX/ZFY）的解釋非常重要，以排除技術問題。
每個實驗室應根據(jù)可用的設備和試劑（如PCR儀和DNA聚合酶的類型）以及DNA質量/數(shù)量/來源，仔細優(yōu)化PCR反應條件。如果結果不明確和/或懷疑存在技術故障，則應重復進行多重反應。如果多重反應對特定的DNA樣本不起作用，則可以在單管反應中運行引物組。如果兩個多重PCR的結果一致支持缺失，則該缺失被確認。如果兩個多重PCR檢測的結果不一致，則應在單管PCR中重復整套引物。單管PCR不易發(fā)生擴增失敗，強烈建議在較低的退火溫度下重復反應。為避免擴增失敗，應極力避免相同引物的重復凍融。關于反應重復次數(shù)，沒有一般性建議，應直到結果清晰和可重復（良好的實驗室建議）。

 

七、遺傳學檢測結果報告

報告應以標準化格式編寫，并應對非專業(yè)人員清晰友好。一般來說，報告必須清楚、簡明、準確和易于解釋，不可以接受手寫的報告。報告必須包括以下一般信息：

 送檢患者的醫(yī)生身份
 檢測和出具報告實驗室的清晰和完整的身份識別（包括唯一的實驗室編號/識別號碼）
 標題
 送檢和報告日期
 患者信息：完整姓名、姓氏、出生日期和生理性別
 樣本類型（如血液、口腔涂片等）
 非專業(yè)人員可以理解的書面解釋和結論
 （至少）兩名獨立評估人員的簽名（包括他們的職責）
 頁碼
 如果報告超過一頁，頁碼應該清晰（如第X頁/共Y頁），每頁都應有患者身份標識

還必須包括以下具體信息：
 以某種形式重述送檢的原因（如，對Y染色體微缺失的診斷）和適應癥（如，無精子癥、ICSI準備、pre-TESE等）。
 所用方法（如多重PCR擴增），包括檢測方法的局限性；如果使用了市售的試劑盒，則必須披露其名稱、制造商和批號。
 如果檢測/分析外包給外部實驗室或公司，必須清楚地說明這些信息。
 分析結果：必須報告被檢測位點的結果。最好利用表格列出所有支持解釋的STS位點結果（注意：如果使用了包含大量位點的試劑盒，建議在報告中只列出與解釋相關的位點結果）。避免使用+和-，這可能會造成誤解，用單詞代替（例如，present/absent，或類似的）。

7.1 Y微缺失檢測的替代方法
自1999年第一份指南發(fā)表以來，已經(jīng)開發(fā)了多種評估Y染色體缺失的替代方法。此外，還提供了各種商業(yè)試劑盒。然而，這些往往包含不必要的大量位點，并由此混淆分析，最終導致“假性”缺失的診斷結果，尤其是在DNA質量和/或PCR條件不理想的情況下。此外，大多數(shù)試劑盒不能通過單管PCR對疑似缺失進行驗證?；诨蛱禺愋晕稽c的多重PCR方法允許檢測孤立的基因特異性缺失，但這些缺失的臨床意義極端罕見和不明確，阻礙了其在常規(guī)診斷中的應用。此外，這些試劑盒中包含基因特異性位點，需對結果進行特別仔細的解釋，并在可能的情況下驗證可疑的單基因缺失。
已公布的替代方法，部分基于指南，部分則沒有，主要包括毛細管電泳、real-time PCR、MLPA、aCGH或下一代測序（NGS）。real-time PCR的優(yōu)點是相對快速，不涉及凝膠電泳，但所需的設備比標準方法更不容易獲得。AZF區(qū)域的特殊結構及其在不同人群中的顯著差異對廣泛實施基于NGS的方法提出了重大挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)可能導致診斷錯誤，并強烈建議在沒有適當驗證和Y染色體分析的廣泛專業(yè)知識的診斷條件下考慮使用基于NGS的方法時要謹慎。隨著這項技術的可用性和正確實施變得越來越普遍，它可能會帶來新的、更全面的檢測，從而進一步提高無精子癥男性的診斷率。

總之，在以前版本的指南中建立的兩步多重PCR仍然是進行Y染色體缺失檢測的最具成本效益、可重復性和最容易獲得的方法。如果實驗室決定建立替代方法，則需要在適當數(shù)量的樣本上驗證新方法，包括陽性和陰性對照，以評估檢測的特異性和敏感性。無論何時采用替代方法，報告都應明確包括所使用的確切實驗設計，而不是將其稱為“根據(jù)指南”。后者僅適用于本文所述的兩步多重PCR+強制擴展性缺失分析。

 

八、EAA/EMQN外部質量評估22年經(jīng)驗

強烈建議進行AZF檢測的實驗室加入年度“EQA計劃”。該計劃每年向參與實驗室分發(fā)三份具有模擬臨床病例特征的、經(jīng)驗證的DNA樣本，處理方式與患者樣本的處理方法完全相同，包括報告。實驗室結果由至少兩名獨立評審員進行評估。從2000年至2012年，參與該計劃的實驗室數(shù)量幾乎增加了兩倍，從57個增加到148個（圖3A），這一數(shù)字在過去10年中一直保持穩(wěn)定。診斷錯誤率也急劇下降，從該項目開始前5年的近8%下降到目前的1%-2%（圖3B）。參與評估的診斷報告質量和結果解釋顯著提高，在過去4年中，超過70%的分析報告獲得滿分。值得注意的是，不必要的大量位點檢測——通常是商用試劑盒的一部分——仍然是解釋錯誤的主要來源。總之，這一既定的EAA/EMQN AZF方案已經(jīng)證明，它是提高參與實驗室績效的一個有價值的工具，建議進行AZF檢測的實驗室都加入該年度計劃。

圖3 EAA/EMQN外部質量控制方案在評估實驗室績效方面的22年經(jīng)驗結果

 

 

參考文獻：

[1] Krausz C, Navarro-Costa P, Wilke M, Tüttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: State of the art 2023. Andrology. 2023;1-18. https://doi.org/10.1111/andr.13514