染色體非整倍體是導致自然流產和體外受精中胚胎移植失敗的主要原因，其發(fā)生率與母體年齡密切相關。對有生育需求的高齡女性進行PGT-A檢測，篩選整倍體胚胎移植，能夠有效降低流產率，提高妊娠率和活產率。

極體（Polar body，PB）活檢、卵裂期胚胎活檢以及囊胚期滋養(yǎng)層細胞活檢是PGT取材的主要方法。與另外兩種方法相比，極體活檢具有對胚胎損傷小、倫理上易被接受、胚胎利用率高以及能夠實現(xiàn)新鮮胚移植等特點[1]。但既往研究發(fā)現(xiàn)，極體活檢的PGT-A在大多數(shù)臨床環(huán)境中不具有成本效益。隨著納米孔測序技術的快速發(fā)展，測序質量的顯著提高，基于此的極體PGT-A將會成為未來的首選嗎？

 

近期，《Clinical Chemistry》（IF=9.300）和《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》（IF=3.100）先后發(fā)表了題為“Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy”、“Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing”的兩篇文章，深入探討了基于納米孔測序技術的極體非整倍體檢測在臨床中的應用價值，快來一睹為快吧！

 

PART 01

納入20例患者的102份混合PB樣本，比較基于常規(guī)aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[2]。研究設計如圖1所示，納米孔測序工作流程如圖2所示。

圖1：研究設計（包括研究中發(fā)現(xiàn)的一致性）。PGT-A：胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測；aCGH：微陣列比較基因組雜交；PPV：陽性預測值；NPV：陰性預測值。

圖2：納米孔測序工作流程的示意圖概述，包括嵌入臨床PGT-A工作流程中的各個操作的時間測量。根據(jù)6個混合樣本的中位測序時間計算每個樣本的比例測序時間。ICSI：卵胞質內單精子注射；PB1：第一極體；PB2：第二極體：WGA：全基因組擴增。

 

納米孔測序與常規(guī)aCGH分析的比較

共有99個樣本質量合格，被納入分析。
01 共99個混合PB樣本用于PGT-A檢測（aCGH與ONT的比較）（圖2）。其中，aCGH檢出整倍體29個（29.3%），非整倍體70個（70.7%）。納米孔測序檢出整倍體32個和非整倍體67個，樣本水平一致性為97.0%，靈敏度為0.957，特異性為1.0，陽性預測值（PPV）為1.0，陰性預測值（NPV）為0.906（圖1）。
02 所有aCGH和ONT分析的結果列在表1中。3例aCGH檢測為非整倍體的樣本經(jīng)納米孔測序檢測為整倍體。
03 在99例樣本中，aCGH分析共檢出195條非整倍體染色體，其中98條為三體，97條為單體，覆蓋23對染色體。在aCGH和/或ONT中發(fā)現(xiàn)的所有受累染色體如圖3所示。在染色體水平發(fā)現(xiàn)98.7%的一致性（2,273條染色體中的2,243條被一致鑒定為正?；虍惓＃?，敏感度為0.896，特異性為0.995，陽性預測值為0.940，陰性預測值為0.990。
04 通過納米孔測序后的生物信息學數(shù)據(jù)分析流水線自動生成的整倍體和非整倍體檢測樣本的實例染色體分布圖如圖4所示。

圖3：99例混合樣本中整條染色體非整倍體的發(fā)生。TP表示在兩種方法中都被檢測到為非整倍體的染色體（TP重復或TP缺失）；FP表示aCGH正常而ONT異常的染色體（FP重復或FP缺失）；FN表示aCGH異常（FN重復或FN缺失）而ONT正常的染色體。“真陰性”（兩種方法中的正常染色體）不顯示。縮寫：TP，真陽性；FN，假陰性；FP，假陽性。

圖4：自動生成的納米孔測序工作流程中的染色體分布圖。對每個染色體的質量值噪聲和MAPD進行了映射，并突出顯示了總樣本的閾值（分別為0.6和1.7）。縮寫：MAPD：所有兩兩差異絕對值的中位數(shù)；噪聲，每段內標準化閱讀計數(shù)的中位數(shù)標準偏差。

 

表1：ONT與aCGH檢測結果比較

 

核酸內切酶消化

評估核酸內切酶消化步驟的重要性。雖然高信噪比的樣本顯示出匹配結果，但額外的消化明顯降低了噪聲，并提高了對具有挑戰(zhàn)性的案例的CALL出。

 

時間和經(jīng)濟成本效益

01 ONT工作流程在1.5h內可完成一個樣本的測序（從擴增的DNA到倍性結果），大約12小時內可完成12個樣品的分析，具有更快的處理速度。此外，ONT方法的優(yōu)勢在于其動態(tài)分辨率的調整能力，這使得它能夠更靈活地生成針對含有三個染色體拷貝的極體樣本的詳細報告，這是傳統(tǒng)aCGH方法所不具備的。
02 整個工作流程的材料成本，包括WGA、樣品制備、測序和數(shù)據(jù)分析，每個樣品從110美元到240美元（100歐元到220歐元）不等。

 

PART 02

納入102個混合PB樣本，比較基于常規(guī)aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[3]。兩種方法工作流程示意圖，如圖1。

圖1：兩種方法的工作流程示意圖：微陣列比較基因組雜交（aCGH）和牛津納米孔技術（ONT）。這兩種技術的初始步驟都是極體活檢和全基因組擴增（WGA），然后是特異性文庫的制備和倍性分類和拷貝數(shù)變異（CNV）分析。

圖2：比較兩個樣本的aCGH和ONT倍性分析。根據(jù)aCGH的平均log2比值閾值進行的倍性分類，以及報告的臨床評估或利用ONT進行的計算機倍體分類。（a）使用aCGH對CNV狀態(tài)進行全基因組分析。（b）使用aCGH檢測每條染色體的平均log2比值（WGA擴增的樣本與對照DNA）。淺灰色條表示與雄鼠對照的信號分布，深灰色條表示與雌鼠對照的信號分布。匯集極體的重復（橙色線表示）和缺失（藍色線表示）的閾值。（c）使用ONT進行全基因組CNV分析。黑點表示大約1 Mb的每個可變寬度bin的總讀計數(shù)。黃色線表示重復，紫色線表示缺失。（d）使用ONT繪制每條染色體的裝箱讀片計數(shù)箱線圖。彩色線顯示預期讀取計數(shù)。黃色線表示重復的預期讀取計數(shù)，紫色線表示缺失的預期讀取計數(shù)。

 

 

非整倍體檢測—ONT vs. aCGH

01 整個基因組的信號模式在視覺上相似，每條染色體的平均值也相近（圖2）。
02 96%（98/102）的樣本的倍性檢測結果（整倍體、非整倍體）一致。4個不一致樣本（ID023、ID028、ID062、ID072），aCGH歸類為整倍體，而ONT歸類為非整倍體（表1）。而最終臨床評估顯示，只有兩個樣本（ID023和ID062）的結果與ONT不同，另外兩個樣本（ID006和ID063）的臨床評估為不確定。

表1：兩種方法倍性分類的樣本數(shù)交叉表

（藍色：一致；紅色：不一致）

每條染色體的非整倍性統(tǒng)計

01 基于aCGH分析的2,346條染色體中，92.5%（2,169/2,346）的染色體倍性分類結果與ONT一致。aCGH檢測的94.0%（47/50）染色單體重復、93.7%（2,032/21,68）整倍體和70.3%（90/128）的染色單體缺失與ONT分類的結果一致（表2）。
02 少數(shù)樣本染色體倍性分類不一致率高。大多數(shù)樣本中ONT數(shù)據(jù)的基線與aCGH數(shù)據(jù)處于不同的水平。例如，對于樣本ID016，將ONT基線與aCGH基線相比較，使差異從17條染色體減少到僅1條染色體（圖3b，d，f）。因此，排除了超過一半染色體為非整倍體的8個樣本，使用ONT進行進一步的一致性分析。除了上述8個樣本，每條染色體的一致性增加到97.7%（2113/2162）（表3）。
03 總體而言，使用ONT的非整倍體染色體數(shù)目高于aCGH（150 vs. 131）。在兩種方法中，染色單體缺失的總數(shù)（ONT：84，aCGH：83）均高于染色單體重復的總數(shù)（ONT：66，aCGH：48）（圖4）

 

表2：兩種方法用于特定倍性分類的染色體數(shù)目交叉表（藍色：一致；紅色：不一致）

 

表3：過濾高度復雜樣本后，兩種方法用于特定倍性分類的染色體數(shù)目交叉表（藍色：一致；紅色：不一致）

 

部分重復和缺失

01 ONT工作流程可自動識別樣本ID050的2號染色體的50 Mb重復，樣本ID005的1號染色體約13 Mb的缺失，樣本ID072的2p重復、7p缺失和Xq重復等微小畸變。通過可視化回顧全基因組分析結果，可以在aCGH數(shù)據(jù)中看到這些畸變（圖3a、c、e）。

圖3：片段性非整倍體檢測（ID005）和基線偏移（ID016）。對于a-d和f，上述給出了使用ONT計算的倍性分類，或者基于aCGH的平均log2比值閾值進行的倍性分類，這與報道的臨床評估一致。a,b.使用aCGH對兩個樣本的CNV狀態(tài)進行全基因組分析。c,d. 利用ONT進行全基因組CNV分析。黑點表示大約1 Mb的每個可變寬度bin的總讀計數(shù)。黃色線表示重復，紫色線分別表示缺失或雙倍缺失。e.上述CNV分析的單染色體視圖（樣本ID005）顯示1號染色體的部分缺失。f. 使用ONT進行全基因組CNV分析，樣本ID016的數(shù)據(jù)集減少到300 k reads

 

圖4：每種方法的染色體重復和缺失的絕對數(shù)量，包括94個樣本（高度復雜的樣本被過濾）

 

所需的讀取次數(shù)和工作流程時間

01 aCGH的工作流程大約需要24小時，包括16小時的過夜雜交步驟。ONT的工作流程可以在相似的時間內對大約1 M的讀數(shù)進行測序和分析。如果計劃進行新鮮胚胎移植，工作流程時間很重要。為了模擬更短的測序時間，將reads的數(shù)量隨機降采樣到300 k，實現(xiàn)了大約5 h的測序時間（圖1）
02 在分析縮減后的數(shù)據(jù)集后，相對于原始ONT結果，每個樣本的倍性分類結果相等，只有兩個樣本的21號染色體缺失小于染色體長度的一半，因此預測不為缺失，而在另一個樣本中，與原始結果和aCGH評估不同，使用縮減后的數(shù)據(jù)集將倍性分類分配為非整倍體。

 

總   結

• 與aCGH相比，納米孔測序具有更多的優(yōu)勢，包括（但不限于）檢測快速、測序價格低廉以及所需的初始投資成本。

• ONT方法在檢測極體的染色體倍性和微重復或缺失方面展現(xiàn)了明顯優(yōu)勢，特別是在考慮到匯集的極體中存在三個染色體的情況下。

• 相較于標準的商業(yè)aCGH方法，ONT技術能夠更準確、高效地評估染色體狀態(tài)，為PGT-A提供了一種新的、更優(yōu)的檢測方案。

 

參考文獻

[1] 陳佳, 伍瓊芳. 極體活檢在胚胎植入前遺傳學檢測中的臨床應用價值[J].中華生殖與避孕雜志, 2022, 42(11):6.DOI:10.3760/cma.j.cn101441-20220831-00374.

[2] Oberle, A., Hanzer, F., Kokocinski, F., Ennemoser, A., Carli, L., Vaccari, E., Hengstschläger, M., & Feichtinger, M. (2024). Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy. Clinical chemistry, hvae024. Advance online publication. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvae024

[3] Madritsch, S., Arnold, V., Haider, M., Bosenge, J., Pfeifer, M., Weil, B., Zechmeister, M., Hengstschläger, M., Neesen, J., & Laccone, F. (2024). Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing. Journal of assisted reproduction and genetics, 10.1007/s10815-024-03108-7. Advance online publication. https://doi.org/10.1007/s10815-024-03108-7